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趙新燕

（聊城萬(wàn)合工業(yè)制造有限公司，山東 聊城252022）

石杉?jí)A甲(Huperzine A)是從石杉科植物千層塔[Huperziaserrata(Thumb.)Trev(又名蛇足石杉)]中分離得到的生物堿。它是一種強(qiáng)效、低毒的可逆性乙酰膽堿酯酶抑制劑^[1-3]，可用來(lái)治療重癥肌無(wú)力、跌打損傷和老年癡呆等癥^[4-5]。石杉?jí)A甲片劑已通過(guò)衛(wèi)生部審批，在國(guó)內(nèi)出售并部分出口國(guó)外^[6]。

石杉?jí)A甲治療指數(shù)很高^[7-9]，但在天然產(chǎn)物中的含量很低。傳統(tǒng)的提取工藝是將生藥通過(guò)溶劑萃取，上柱層析分離，重結(jié)晶等工序。所要求的技術(shù)含量高，要經(jīng)過(guò)多次層析，反復(fù)重結(jié)晶，才能達(dá)到較高純度，產(chǎn)量低，條件不易控制，周期長(zhǎng)，成本高。本文采用制備型高效液相色譜分離了石杉?jí)A甲，分離工藝簡(jiǎn)單，提取率高，所得石杉?jí)A甲質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高（90%以上），為進(jìn)一步利用制備型高效液相色譜法工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)石杉?jí)A甲提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1  實(shí)驗(yàn)部分

1.1  儀器

高效液相色譜儀含GLP3250泵，可更換泵頭兩個(gè)（250ml）,GLP色譜工作軟件，UC-3292檢測(cè)器；超聲清洗機(jī)，PH測(cè)定儀。

1.2  試劑與試藥

氯仿，甲醇，氨水，硫酸，氫氧化鈉，純水（均為分析純）；石杉?jí)A甲對(duì)照品（99.1%含量）；千層塔來(lái)源于重慶，經(jīng)鑒定符合中華人們共和國(guó)藥典（2010版）規(guī)定。

1.3  色譜條件

分析條件：色譜柱（ID4.6×250mm，C18,粒徑5μm）；流動(dòng)相：甲醇—水（85：15）；流速：1ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：231.3nm；進(jìn)樣體積10μl。

制備條件：色譜柱（ID63×700mm，Diamonsil C18,粒徑25~40μm）；流動(dòng)相：氯仿—甲醇—氨水（840：24:1.2）；流速：40ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：311nm；進(jìn)樣體積5ml。

1.4  樣品的處理

取藥材粉碎，過(guò)20目篩，取干燥的千層塔粗粉1.6kg，加入10倍體積的PH為1的硫酸溶液，浸泡一段時(shí)間12小時(shí)，超生浸提幾分鐘，提取幾次，合并酸液；加氫氧化鈉溶液調(diào)PH至9，再加氯仿反復(fù)提取，并濃縮至膏。

1.5  石杉?jí)A甲的制備

將按照1.4節(jié)方法制備的石杉?jí)A甲固體提取物用制備色譜的流動(dòng)相配制成體積為10mL的溶液，用孔徑為0.45 μm的濾膜過(guò)濾，作為制備液。在1.3節(jié)制備色譜條件下開機(jī)，待基線穩(wěn)定后進(jìn)樣，收集相應(yīng)餾分，經(jīng)蒸發(fā)濃縮，結(jié)晶即可，得石杉?jí)A甲晶體。

1.6  制備樣品的質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定

精密稱取按照1.5節(jié)制得的石杉?jí)A甲2mg，用分析色譜流動(dòng)相定容于10mL容量瓶中。按照石杉?jí)A甲含量測(cè)定方法^[10]對(duì)所制得的樣品進(jìn)行石杉?jí)A甲純度檢測(cè),符合質(zhì)量要求。

2  結(jié)果與討論

2.1  流速對(duì)分離石杉?jí)A甲的影響

將分析型液相色譜按比例擴(kuò)大為制備型液相色譜時(shí)，盡可能使制備柱的固定相類型、溶劑組分等方面與分析柱保持一致，通常柱長(zhǎng)保持大體相同，以增加柱徑來(lái)達(dá)到更大的柱容量，這樣，只考慮流速問(wèn)題，可以從下面關(guān)系近似得到最大流速：

制備柱流速=×分析柱流速

根據(jù)石杉?jí)A甲制備條件中流速大小^[11],結(jié)合上式，計(jì)算得出大流速為79.38 ml/min。

稱取粉碎干燥的千層塔粗粉1.6kg（共7份），按照1.4和1.5節(jié)操作，以氯仿—甲醇—氨水（840：24:1.2）為流動(dòng)相，考察不同流速對(duì)石杉?jí)A甲分離效果的影響，結(jié)果見表1。

表1可知：隨著流速的增大，石杉?jí)A甲的保留時(shí)間逐漸減小，分離度降低，柱壓升高；隨著流速減小，保留時(shí)間延長(zhǎng)，分離度增大，但流速太小時(shí)，保留時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，且色譜峰變寬；流速的變化對(duì)石杉?jí)A甲純度的影響不是很大，所以為了縮短分離時(shí)間，且保持良好的分離度，選擇流動(dòng)相的流速為40ml/min。

2.2  進(jìn)樣質(zhì)量濃度對(duì)分離石杉?jí)A甲的影響

分別稱取粉碎、過(guò)篩、干燥的千層塔粗粉1000、1200、1400、1600、1800g，按照1.4和1.5節(jié)進(jìn)行操作，考察了進(jìn)樣質(zhì)量濃度對(duì)分離石杉?jí)A甲的影響，結(jié)果見表2。

表1  流動(dòng)相的流速對(duì)分離石杉?jí)A甲的影響

由表2可知：隨著進(jìn)樣質(zhì)量濃度增大，保留時(shí)間逐漸增大，分離度降低，洗脫時(shí)間延長(zhǎng)，所得石杉?jí)A甲的質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低；進(jìn)樣質(zhì)量濃度低時(shí)分離度較高，洗脫時(shí)間較短，所得石杉?jí)A甲的質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，但生產(chǎn)效率下降。為保證所制石杉?jí)A甲既有較高的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，又有較高的生產(chǎn)效率，選擇進(jìn)樣質(zhì)量濃度為160g(生藥材)/mL。

2.3  進(jìn)樣量體積對(duì)分離石杉?jí)A甲的影響

稱取粉碎、過(guò)篩、干燥的千層塔粗粉1600g（共6份），按照1.4節(jié)進(jìn)行操作，得6份石杉?jí)A甲固體提取物，分別用制備色譜條件中的流動(dòng)相配置成體積為2、3、4、5、6、7ml的制備樣品溶液，用孔徑為0.45 μm的濾膜過(guò)濾，得制備液。按1.3節(jié)制備色譜條件進(jìn)行純化分離，考察了進(jìn)樣質(zhì)量體積對(duì)分離石杉?jí)A甲的影響，結(jié)果見表3。

表2  進(jìn)樣質(zhì)量濃度對(duì)分離石杉?jí)A甲的影響

表3  進(jìn)樣量體積對(duì)分離石杉?jí)A甲的影響

由表3可知：隨著進(jìn)樣體積增大，石杉?jí)A甲質(zhì)量分?jǐn)?shù)先增大又減小，分離度先增大后減小，保留時(shí)間逐漸增大，當(dāng)進(jìn)樣體積大于7mL后，色譜分辨率降低，洗脫時(shí)間延長(zhǎng)，所得冬凌草甲素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低。進(jìn)樣體積不能太小，否則色譜分辨率太低，冬凌草甲素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低。綜合考慮，要分離制得質(zhì)量分?jǐn)?shù)高的產(chǎn)品，進(jìn)樣體積以5mL較好。

2.4  石杉?jí)A甲質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)量結(jié)果

按照上述2.1-2.3節(jié)確定的條件分離制備了8批石杉?jí)A甲樣品，按照1.6節(jié)條件測(cè)定其質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見表4，表中數(shù)據(jù)均為3次測(cè)定結(jié)果的算術(shù)平均值。

表4  石杉?jí)A甲質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定結(jié)果

由表4可知，采用制備型高效液相色譜法所制得的石杉?jí)A甲的質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，均能達(dá)到Huperzine A的純度大于90%的技術(shù)要求。

3  結(jié)論

我們用制備型高效液相色譜法制備分離石杉?jí)A甲。1.6kg千層塔可以得到近320mg的Huperzine A，重復(fù)性好，產(chǎn)品純度達(dá)到了技術(shù)要求。本方法成本低，可為工業(yè)化生產(chǎn)工藝提供參考。

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